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免疫组化结果分析
发布时间:2015-02-15

1. 免疫组化结果分析

目前,免疫组化技术已经作为一项成熟的技术被广泛应用,然而对于免疫组化结果的分析并没有一个权威的说法。有很多文献描述了免疫组化结果分析,但都没有详细的分析过程和方法。在这里,CellLab为大家总结了应用ImagePro Plus软件来分析免疫组化结果的详细过程。 

2. 免疫组化的分析原理

目标蛋白的量是由染色的深浅(光密度)及分布面积大小共同决定的。其中染色的颜色深浅(光密度)与目标蛋白量是对数关系,染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。光密度值(OD值)与染色物质的相对量直接相关,因此免疫组化照片的分析结果应该是OD值。将一张图片上每个点的光密度值累加起来得到IDO(Integrated option density)值,就代表了目标物质的总量。而IOD值除以目标分布区域的面积,得到的平均光密度值(mean density)则反映了目标物质的单位面积浓度。免疫组化的结果分析,就是比较不同组间平均光密度值的大小。

3. 什么是ImagePro PlusIPP)?

Image-Pro Plus 是一款功能强大的2D和3D图像处理、增强和分析软件。它不仅具有异常丰富的增强和测量工具,还允许用户自行编写针对特定应用的宏。其适用范围广泛,在科研、医学及工业领域都有应用。

IPP能准确地按照一个颜色标准来选取一个我们最感兴趣的测量区域:AOI (area of interesting )。AOI是IPP中最有用最重要的概念,也是IPP软件的优势所在。因此,使用IPP做免疫组化分析时,得出的分析结果比其他方法都更为准确。 

4. 免疫组化照片的拍摄要求

1、所有照片必须在完全相同的显微镜条件下拍摄,并且所有样品必须一次拍摄完全。调整显微镜光源为足够明亮的白色光,并保持稳定,不能随意调整。更换样品时,除了调节载物台位置,其他部件一律不能动!在拍摄过程中,不能来回切换不同放大倍数的物镜。使用一个物镜拍摄所有的照片后,再切换到另一个物镜上拍摄照片。

2、染色深的阳性样品应该拍摄得较暗。染色浅的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。控制相机曝光时间使照片中空白的地方尽可能呈现纯亮的白色。没有组织的空白处的背景灰度值应控制在230左右。

3、数码相机必须设置为手动曝光,保持每张照片的曝光条件相同。需要特别注意的是将数码相机的自动白平衡功能关掉!照片最好保存为TIFF格式。

5. IPP分析免疫组化图片的步骤

1、选取图片上具有染料色调的区域AOI。

2、测量该区域的IOD。

3、选择并测量有效统计区域的面积。

4、计算平均光密度值。

5、计算同一实验组切片各照片的平均值及标准差。

6、用统计学方法分析不同组间是否有显著性差异。

6. 具体分析方法

1、打开IPP程序,熟悉一下程序界面。IPP的界面是典型的windows风格,包含了一些常用的工具。熟悉之后就打开待处理的照片。

2、校正图片光密度。选择Measure, Calibration下intensity carlibration指令,调出窗口,点New建立一个新的校正。选择std option density,并点option按钮,弹出optical density calibration对话框,点击incident level预编的image按钮。弹出新的对话框后,将鼠标移到图片空白处点一下,就能看到显示部位的灰度值。白色背景能达到250,点击OK返回就可以了。最后,在窗口右上方点击一下system,使这个校正能应用于所有图片。

3、选择测量参数。调出Measure下count/size窗口,在Measure下选择测量项目,主要是两项IDO和area两项。然后设置options,outline:filled,label style :none,dark background on sample : no,smoothing:1,filled hole: on,clean border : none。在count/size窗口中点file save settings,保存环境设置文件。

4、选取特定颜色。在count/size窗口中点select color,调出segmentation工具。点击Histogram Based,将RGB改成HIS颜色系统,在弹出的的警告上点“是”。选取相应参数:H:0-30,S:0-255,I:0-230。保存选色设置,默认文件为rgb24.rge。

5、测量灰度图片。直接在彩色图上测量光密度,通常会带来系统误差,因此把图像转换为灰度图片,测量结果会更准确。具体操作是:选完颜色后,在segmentation窗口里的view下面选择transparant on white;然后点create preview image复制这张图片;在edit下将图片转成Gray Scale 8灰度格式;再做一次选色,此时select color 变成了 select ranges,只有一个选择,将I的范围设置成0-240。点count进行测量。在view下,选择Statistics调出统计结果,这里只有IDO SUM 是有意义的测量值。

6、测量面积。如果组织或细胞填满了整个照片,没有空白,那么这个面积就是照片面积,无需测量。然而通常情况下,拍摄的组化照片会出现一部分空白,没有任何组织或细胞,这时候就需要将空白的面积扣除。这时候就需要用到irregular AOI工具来选择测量区域。在工具栏中    就是irregular AOI工具,点击图标,调出irregular,这个工具就类似于不规则抠图工具,沿着细胞的边界将细胞圈起来,点击右键就确定了一个不规则形状。如果还要在同一张图上再选择另一个区域,先要点击工具栏上multiple AOI按钮,再点击add,就可以再选择一个区域。选好测量区域后,在count/size窗口中点edit,选择convert to object后就能看到测量数据,注意这里只有area SUM有意义。

7、数据处理。前面说到mean density反映了目标物质的单位面积浓度,因此我们的最终目标就是得到mean density值。计算公式:mean density =  (IOD SUM) / area SUM,需注意mean density 与 IOD 都是个相对值,所以没有单位。最后,计算同一实验组各照片的平均值及标准差,用统计学方法分析不同组间的统计学差异。


应用ImagePro Plus软件分析免疫组化结果的方法就介绍到这里,有疑问请上CellLab(http://celllab.cn.s10.ctrl.net.cn/)在线提问。


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