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实验服务
常见问题
常见问题  
Western blot 实验中常见问题及解决方法
发布时间:2015-05-26

一、SDS-PAGE电泳过程

问题1. SDS-PAGE电泳过程中凝胶漏液或凝胶面不平

应对措施:

1)玻璃板洗刷干净

2)加入的AP和TEMED的量要准确

3)凝胶混合液配好后要充分混匀

4)控制电压或采取措施(冰上,冰箱)保证凝胶温度一致

5)玻璃板底部对齐

6)架子要夹紧,防止漏胶造成胶面不平

问题2. 条带比正常的窄?条带向上弯或向下弯?

应对措施:

1)凝胶聚合不均匀,灌胶时尽量混合均匀,动作轻缓

2)拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲

3)样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一,纯化样品,调整盐浓度

4)胶板底部有气泡会影响电泳效果,应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适

5)每个加样孔体积应一致,防止由于体积不同导致不同孔之间的挤压

二、转膜及抗体检测过程

问题1. 凝胶肿胀或卷曲?

应对措施:可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min

问题2. 条带歪斜或漂移?

应对措施:电转仪长期使用导致海绵变薄,“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸

问题3. 单个或多个白点?

应对措施:确保膜和胶块之间没有气泡

问题4. 转膜缓冲液过热?

应对措施:缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。转膜过程注意降温

三、转移到膜上的蛋白很少

原因1. 蛋白分子量<10KD

应对措施:蛋白分子量<10KD时,减少转膜时间,使用小孔径的膜

原因2. 蛋白分子量过大

应对措施:增加转膜时间,过程中注意保持低温

原因3. 蛋白的等电点<9

应对措施:更换高PH值Buffer

原因4. SDS浓度不合适

应对措施:转移缓冲液加入终浓度0.1% SDS,也是为了增加转移效率

原因5. 凝胶太厚

应对措施:延长转膜时间,过程中注意保持低温

原因6. 转膜效率低

应对措施:

1)转移缓冲液中加入20%甲醇(终浓度),因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质和膜的结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间

2)用优质的转移膜



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