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免疫组化的注意事项及常见问题解答
发布时间:2015-06-19

免疫组化注意事项:

一、组织固定越新鲜越好;

二、组织脱水必须彻底干净; 

三、切片必须完整、均匀、平展、无气泡;

四、切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不轻易脱片,又不至于破坏抗原;

五、切片脱蜡必须干净;

六、必须彻底抑制内源性过氧化物酶的活性;

七、须适当合理地使用封闭试剂;

八、连接抗体的选用必须正确,否则可能造成假阴性的现象;

九、注意复合物的使用及孵育时间的确定。

常见问题解答:

1. 石蜡切片与冰冻切片的优缺点?

答:石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构,且只需存放在室温,而冰冻切片比较麻烦,一定要存放在-80℃的冰箱中。此外,石蜡切片可以切到4微米左右,染色得到的颜色/形态都较冰冻切片好。

冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性,做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构,可能会使抗原弥散;切片厚度较石蜡的厚,做的片子没石蜡的漂亮。

2. DAB显色时间如何把握?

答:(1DAB显色时间不是固定的,主要由显微镜下控制显色时间,到出现浅棕色本底时即可冲洗;

2DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间;

3DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长;

4)此外,若很短时间就出现背景很深,还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全,需要延长封闭时间。

3. 全片着色出现的原因及解决办法?

答:全片着色是指整个切片全都染上了颜色,着色的强度可深可浅,总之,分不清那些组织是阳性那些组织是阴性。出现这种现象的原因有:

1)抗体浓度过高:一抗浓度过高是常见的原因之一。解决办法是,每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简单的按说明书进行染色。

2)抗体孵育时间过长或温度较高:解决办法是,严格执行操作规程,最好随身佩带报时表或报时钟,及时提醒,避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的1小时,而是30分钟,因此,要根据染色结果进行调整。

3DAB变质和显色时间太长:DAB最好现用现配,如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的DAB不应存放时间太长,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低DAB的效力,未用完的DAB存放在冰箱里几天后再用这种似乎节约的办法是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控,达到理想的染色程度时立即终止反应。

4)组织变干:修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等都是造成组织变干的原因。解决的办法是操作要认真仔细,采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈,可以有效的避免液体流失,也能提高操作速度。

5)切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长(大于24小时):原因上不清楚,但现象存在。有的实验室喜欢前一天将切片脱蜡至修复,第二天加抗体进行免疫组 化染色,如果将装有切片和修复液的容器放在4℃冰箱过夜,对结果无明显影响,如果放在室温,特别是炎热的夏天,会出现背景着色,因此,不可存放时间太长。

6)一抗变质、质量差的多克隆抗体:注意抗体的有效期,过期的抗体要麽不显色要麽背景着色。用新买的抗体时最好设立阳性对照和用使用过的抗体作比较。

4. 脱片产生的原因有哪些?

答:(1)多聚赖氨酸玻片质量的问题。

2)组织切的不好,切片机的问题例如比较老的旧的机器切的厚或者不均匀,或者切片者手法不好等。

3)没烤好,时间短,温度不够之类。

4)操作的时候甩的太猛了,有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻轻甩,用卫生纸从边缘上慢慢吸水。

5)修复的问题:抗原修复的时候高压时间过长了,或者放进100度的修复液时手法不好,咚的一声就丢进去了,这样超容易脱片。此外,用EDTA修复比柠檬酸容易脱片,但是你要用到EDTA的时候也没办法,只有从另外的问题上着手。

6)一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎,用PBS的时候尽量用泡的,不要冲。基本上把这些方面都注意到了,能改善的尽量改善,脱片可以减少很多。

7)组织的问题,越是癌症组织有坏死之类越容易脱。

5. DAB显色后发现切片着色不均匀?

答:(1)切出的片子厚度本身可能就不一样,切出一片厚,一片薄,这样可能造成着色深浅不一。

2)有可能是你的显色液底物加到片子上后没有摇匀,造成局部底物浓度不一致,所以加完显色液后最好将片子来回左右晃动几下,使片子上所有区域的底物浓度一致。

3)如果你的片子是中间的染色深,靠近边上的浅,那有可能是你蜡圈画的太小,显色液覆盖的面积不过大而产生了边缘效应。最外侧的组织片最好离显色液外缘0.5cm

6. 免疫组化结果如何分析?

答:(1)阳性着色细胞计数法。在40×光镜下,随机选择不重叠的10个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组3~6张不同动物组织切片,然后进行组间比较即可。

2)灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用ImagePro Plus软件进行灰密度分析,然后进行统计分析即可。

3)评分法。通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1~4分为0~25%26~50%51~75%76~100%),最终可以分数相加,再进行比较。

对于以上这几种方法,各有利弊,请细心选择。要想得到正确结果的前提是你要做出着色均匀、背景很浅的高质量切片。

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