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miRNA第一链合成试剂盒  
miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit miRNA cDNA 第一链合成试剂盒
发布时间:2016-08-22
miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit miRNA cDNA 第一链合成试剂盒

目录号:EY001

 

产品内容

产品组成

EY001 (20 rxn)

E.coli Poly(A) Polymerase

10 μl

10×EPAP Reaction Buffer

20 μl

ATP (10mM )

25 μl

MnCl2 (25mM )

25 μl

RT-Primer (10μM)

75 μl

dNTP Mixture (10 mM each)

25 μl

5×RT Buffer

100 μl

RNase Inhibitor (40 U/μl)

7.5 μl

RT Polymerase (200 U/μl)

25 μl

miRNA Universal Primer (10μM)

40 μl

RNase Free dH2O

1 ml


储存条件

-20℃保存


产品简介

本试剂盒采用在miRNA 3’末端加多聚A尾Poly(A),再使用Oligo(dT)-universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应,最终生成miRNA对应的cDNA第一链。

miRNA cDNA第一链合成试剂盒包含miRNA 3’末端Poly(A)修饰过程和逆转录过程的所有试剂,该试剂盒具有高效的Poly(A)修饰和逆转录效率,可从20 pg-2 μg的total RNA中有效制备miRNA 对应的cDNA第一链。

注:本试剂盒须与miRNA Universal Primer或者miRNA荧光定量检测试剂盒配套使用。本试剂盒可以用总RNA或者miRNA作为模板。


注意事项

miRNA的检测,一定要预防RNA(RNase)污染,应注意以下几方面:

1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。

2. 使用无RNase的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3. RNA在裂解液中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。

4. 配制溶液应使用无RNase的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%( v/v),放置过夜,高压灭菌。


 操作步骤

一、miRNA 3' 末端进行加Poly (A)处理

1. 在冰上预冷RNase Free 的反应管内加入以下试剂至总体积10 μl (最后加入 E.coli Poly(A) Polymerase)

试剂

使用量

E.coli Poly(A) Polymerase

0.5 μl

10×EPAP Reaction Buffer

1 μl

10mM ATP

1 μl

25mM MnCl2

1 μl

Total RNA

最大量2 μg *

RNase Free dH2O

Up to 10 μl

*在反应中使用的Total RNA最大使用量为2μg (一般1μg足够),是用总RNA作为模板;miRNA作为模板时,需要根据目的miRNA丰度决定加入量(建议加入量为2-5μl)。


2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后在37℃反应60 min。所得的反应液可以直接进行下游实验,也可以放置-20℃短暂保存。如需长期保存建议存放于-80℃。


二、Poly (A)修饰的miRNA 进行逆转录反应

1. 按照下表组分进行反应液的配制

试剂

使用量

RT-Primer (10μM)

3 μl

dNTP Mixture (10 mM each)

1 μl

上述反应液

10 μl


2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后65℃保温 5 min 后,冰上迅速冷却。(上述处理可使模板 RNA 变性,提高反转录效率)


3. 在上述反应管中配制下列反转录反应液,总量为 20μl。

试剂

使用量

上述变性后反应液

14 μl

5× RT Buffer

4 μl

RNase Inhibitor (40 U/μl)

0.5 μl

RT Polymerase (200 U/μl)

1 μl

RNase Free dH2O

Up to 20 μl


4. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液,短暂离心后按下列条件进行反转录反应:

42℃   60 min

95℃   5 min (酶失活)

冰上冷却


合成的cDNA反应液可以直接进行下游的荧光定量PCR检测,或放置于-20℃保存。


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