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免疫和病理实验  
染色质免疫共沉淀(ChIp)
发布时间:2015-01-31
染色质免疫共沉淀(ChIp)

一、服务介绍

 染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是用于研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。CHIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。

二、实验原理

在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段;然后再通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并进行纯化、鉴定及后续分析,而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

三、实验流程:

1.取适量细胞,加入适量37%甲醛,稀释,使甲醛的终浓度为1%。37°C孵育;

2.加入一定浓度的甘氨酸混匀,在室温下放置5min,以终止交联;

3.吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞3次;

4.用细胞刮刀收集细胞。预冷后离心,并收集细胞;

5.倒去上清,根据细胞用量,加入适量SDS裂解液。之后,加入蛋白酶抑制剂;

6.超声破碎;

7.超声破碎后,4°C离心,去除不溶物质,取上清。留取一部分做实验(其中三分之一加抗体作为实验组;另外三分之一加入NaCl解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果;最后三分之一不加抗体作为对照组),其余-80°C保存;

 8.其中三分之一加入适量ChIP稀释缓冲液,再各加入适量ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA,4°C颠转混匀;

 9.4°C静置沉淀,离心;

10.取上清。各留取一部分作为input,一管中加入适量抗体,另一管中则不加抗体。4°C颠转过夜;

11. 沉淀并清洗步骤9中得到的免疫复合物;

12.依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,4°C颠转数分钟后,静置沉淀,离心,去除上清;

13.洗脱沉淀复合物:加入洗脱缓冲液,室温下颠转数分钟,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次;

14.解交联:加入NaCl混匀,解交联过夜;

15.解交联结束后,加入RNaseA(MBI)孵育;

16.加入EDTA,Tris HCl,蛋白酶K,45°C处理;

17.利用回收试剂盒DNA片段,将最终样品溶于ddH2O中;

18.PCR分析

注意事项:

1. 注意抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,能用于免疫组化的不一定能用在ChIP中。因此,要详细了解抗体的使用说明,尤其是多抗的特异性问题。

2.多数抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使抗原溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白;即便溶解也会产生与其它蛋白结合的结果,抗原决定簇被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的结果。

3. 为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂,且在低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则不能沉降在beads上,而残存在上清。此外,缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则会导致抗原被稀释。

四、服务说明

1.客户提供:

新鲜组织(液氮或-70°C保存),培养的细胞。对样本材料的具体要求和运输条件请提前与我司沟通;用于免疫共沉淀的一抗(如果公司抗体库里没有)及目的蛋白的相关信息。

2.公司提供:

       Western blot检测图,PCR产物电泳图;完整的实验报告,包括对每个步骤的详细说明(具体操作方法、试剂或溶液浓度等), 以及相应的结果及分析。

3.实验周期:

       3-4周。

五、质量承诺
提供清晰的图片、可靠的数据和分析结果。


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